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真菌长期保藏与性状变化
日期:2016/10/28 访问:

真菌长期保藏与性状变化

顾金刚[1] 李世贵 姜瑞波

(中国农业微生物菌种保藏管理中心 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所

北京市中关村南大街12号 邮编:100081)

 

 

      摘要:微生物保藏的终极目标是保持菌株的纯度、活性、基因信息的完整性、避免菌株变异和降低退化可能性,以备将来使用。真菌菌株在长期的保藏过程中,一些菌株会菌落形态出现“角变”,酶活力下降,致病力丧失等现象,本文简要概述了真菌的长期保藏及其主要形态、生理生化性状变化的相关进展。

 

      关键词:长期保藏  形态性状 生理生化性状

   

      真菌资源的研究利用多以培养物方式保藏,在多数情况下,真菌资源保藏者一般只监测菌株的活性指标,而真菌形态特征、菌株酶活、致病力、产生次级代谢物的能力等菌株功能特征是否稳定却由于技术、工作量等原因往往被忽略。真菌的长期保藏要保证菌株的生理性状和遗传信息的完整性[1]。本文通过简述真菌长期保藏过程中一些菌株的形态、生理生化性状的变化,旨在引起对真菌长期保藏与监测的重视。


真菌的保藏方法及优缺点分析

      目前有很多保藏方法可以适用于真菌的保藏,但大体来可以分为三类:一是让真菌连续生长的保藏工艺[2]。这一类的保藏工艺的特点是不断的将菌株移植在新鲜的培养基上,并在合适的条件下生长,随后置于一个低温的环境中,一般是4-10℃,这类保藏工艺主要包括斜面移植、油管保藏和蒸馏水保藏法等。二是利用干燥环境保藏菌株的休眠体,如分生孢子、厚垣孢子等,干燥选用的基质可以是空气、硅胶、土壤、沙子等。三是利用抑制菌株代谢活性的办法达到长期保藏,一般是通过脱水降低细胞内水分或低温冷冻,在此过程中关键环节是避免和降低冰晶对细胞造成的伤害,这类保藏工艺包括冷冻干燥法、低温冻结和液氮保藏法等。Ryan和Smith对各种保藏方法进行了优劣比较[3]

      大多数真菌资源研究利用基本上是以得到纯的培养物为前提,而真菌在培养的过程中,必然离开原来的生长环境,营养、环境条件发生改变,这是真菌发生性状改变的重要因子,真菌培养物长期保藏就会不可避免的发生性状变化。难以培养的真菌以及一些专性寄生真菌不能在人工培养基上培养生长,其主要原因是在目前认知条件下,不能够提供此类微生物生长所需的必要条件。此外,丝状真菌保藏一般采用保藏真菌的孢子、菌丝,其中保藏真菌的孢子一般周期较长,活性较为稳定,但无论在无性阶段产生分生孢子还是有性阶段产生的性孢子,都是经过基因重组阶段,这就增加了保藏菌株发生变异的可能性[4]。真菌在分离、培养、保藏的工艺处理、长期保藏、保藏后复活等环节上,都有可能造成真菌细胞发生损坏或基因组信息缺失,从而引起性状发生变化。

 

长期保藏对真菌培养特征的影响


      对于用于分类研究的模式菌、教学研究、专利菌株保藏以及作为环境参考菌株来说,保持真菌培养特征的稳定性是非常必要的。低温保藏一般认为可以降低真菌的代谢速率,但Tian和Bertolini报道了Botrytis allii 和 Penicillium hirsutum 在低温保藏下孢子萌发时间提前和萌发管延伸速度加快[5]。Wing等发现Fusarium compactum 和 Fusarium acuminatum菌株经过连续10次的单孢和菌丝生长尖端分离后,菌株发生退化[6]。Kim观察到了Fusarium oxysporumf.sp.niveeum 菌株经过保藏后菌丝变细、变薄,经过18次的连续传代培养后,发生“角变”,菌落形态发生变化以及不再产生色素,且“角变”的性状在以后的传代培养中保持不变[7]Pholiota nameko 菌株长期保藏后用于接种生产后,产量下降,其原因是子实体形成滞后和数量下降,菌丝的生长速度和漆酶的活性发生变化。目前虽然很少有文献报道真菌在长期保藏过程中引起的孢子大小、产孢特征等性状的变异情况,而产孢能力下降,活性降低报道较多。Aparecido等对一些植物病原真菌长期保藏后的活性、致病力、孢子萌发等指标进行了监测[8]。Maria等[9]在比较蒸馏水和矿油保藏三年的保藏结果中,二株Aureobasidium pullulans 和一株Thamnidium elegans矿油保藏没有检测到活性,而蒸馏水保藏方法中Absidia glauca Alternari dianthicola Colletothrichum coccodes Fusarium fusarioides Gliocladium roseum等5个菌株没有检测到活性,同时发现保藏于矿油中的Aspergillus flavescens Colletotrichum coffeanum Fusarium culmorum Fusarium oxysporum Giliocladium roseum Verticillium lecanii各一个菌株丧失了产孢特性。


长期保藏对真菌生理生化性状的影响

      对于一些病原菌来说,真菌长期保藏过程中如何避免致病力的丧失成为最大的难题,真菌长期保藏过中,致病力下降的报道较多。Kelly 等发现Fusarium oxysporum f.sp. ciceris经过六年的在PDA培养基上大量的转接后在接种到鹰嘴豆上没有致病力[10]。一些保藏在蒸馏水中的Phytothphora 菌株经过长期保藏后也丧失了致病性[11]。Ryan 和 Ellison [12] 用原位结合超低温保藏的技术方法对Puccinia spegazzinii菌株进行了保藏处理,经过保藏后的菌株依然有产生担孢子的能力,但对寄主侵染能力下降,在叶柄的侵染没有成功。一些昆虫和植物的病原菌如果不经过回接到寄主昆虫或植物,也会逐渐丧失其致病性。Mota等[13]验证了Arthrobotrys robusta和 Monacrosporium thaumasium菌株结合线虫的不同保藏工艺处理对捕食线虫能力的影响,发现添加保护剂可以提高Arthrobotrys robustaMonacrosporium thaumasium菌株防治线虫的能力。López Lastra等[14]对一些Hyphomycetes Entomophthorales Trichomycetes和 Oomycetes的9株内生病原真菌进行了18个月的长期保藏的试验,并在第3、6、12、18个月分别监测保藏菌株的活性及其侵染性,Paecilomyces fumosoroseus菌株蒸馏水、矿油、-20℃和-80℃保藏等几种保藏方法都适合,Smittium culisetae 和 Leptolegnia chapmanii 菌株只适合于蒸馏水和矿油保藏。Tommerup用冻干法保藏VA真菌,并监测了其孢子萌发能力、菌丝生长能力以及定殖能力[15]。对于一些菌株的致病性等能力的丧失,可以用一些酶活和代谢产物的指标进行监测[16]。Shinohara 等[17]发现,用于酿酒的Saccharomyces cerevisiae 菌株经过多次的斜面转接后,引起了酒品质的变化。


      真菌次级代谢产物一直是真菌学研究利用的重点,真菌可以产生一系列的次级代谢产物[18], 并且一些典型的代谢产物可以用于真菌类群的划分[19]。Svendsen 和 Frisvad报道次级代谢产物chemosystematics应用聚类分析分析279株青霉真菌到种的水平上[20]。对于真菌次级代谢产物的生产菌株来说,产生代谢产物功能的稳定性保藏及其重要,但是真菌在保藏及其生产等过程中可能丧失产生某一种代谢产物的能力。Svendsen 和 Frisvad发现两株Penicillium comembertii 丧失了产橘霉素的能力(citrinin)[20],这两株菌Bridge 等报道能够产生橘霉素[21]。真菌菌株发生退化可能是真菌产生次级代谢产物的情况发生了改变[22]、[23]。Ryan在对Metarhizium anisopliade Fusarium oxysporum 菌株进行保藏处理后发现次级代谢的产生情况发生了改变[20],菌株产生次级代谢产物的能力对保藏过程极为敏感,多数的保藏物与保藏前的次级代谢产物情况发生了改变,产生次级代谢产物的稳定性随着保藏时间的延长而降低。经过两年的保藏,斜面转接保藏方法保藏的菌株M. anisopliade 和 F. oxysporum都丧失了产生胞外次级代谢物的特点,而用其它保藏方法的一部分菌株产生某些次级代谢产物的特点得以保存。在Ryan[16]研究中还发现,真菌的保藏方法对于菌株的次级代谢产物稳定性保藏局限于“株”的水平上,对于同一种的不同菌株来说,同一保藏方法处理,得到的保藏结果可能就不一样。真菌的次级代谢产物可以应用于分类学、教学研究以及应用于工业生产中,长期保藏过程中菌株次级代谢产物产生情况发生改变,带来的后果将是十分严重。


      真菌有产生多种胞外酶利用多种类型底物的能力,真菌酶作用机理、酶制剂的研究开发历来受到重视,一些诱导酶,如脂肪酶、几丁质酶、蛋白酶等具有降解复杂大分子结构物质的能力,在昆虫、植物病害的生物防治中具有重要作用。活力真菌长期保藏对酶活力变化的影响长期存在。一些商业开发的检测板,如APTZYM、API50CH以及Biolog检测板可以用于分析真菌胞外酶活的变化情况[16] [24] [25] [26]。Ryan在研究M. anisopliade 和 F.oxysporum发现,其胞外酶的分泌能力在长期保藏过程中发生改变,而酶活力是菌株生理稳定性重要指标,不同保藏方法对酶活力的稳定性同样体现在“株”的水平上,而不是“种”的水平[16]。Ryan在F. oxysporum菌株两年的保藏试验中发现,大多数的分离物丧失了α-甘露糖苷酶或β-木聚糖酶活性,壳二糖酶、葡聚糖酶和阿拉伯糖酶活性偶尔丧失[16]M. anisopliade在两年的低温保藏试验中,丧失了β-galacosidase α-fucosidase β-chitobiosidase β-glucuronidase的活性。M. anisopliadeM1菌株的leucine arylamidasde的活性在所有经过蒸馏水保藏的分离物中能够检测到,而在冻干和低温保藏的分离物中部分能够检测到leucine arylamidasde的酶活。而对于tryspin的酶活检测,在-20℃的低温保藏处理和蒸馏水的保藏tryspin的酶活力情况保藏最好。


      分子生物学在近20年的时间里发展较快,基于PCR技术使真菌长期保藏后的基因信息完整性检测成为可能,如果真菌在保藏过程中基因信息发生缺失的话,那就有可能真菌的一些有价值的生理性状、产酶能力遭到破坏。对于模式菌保藏过程中基因信息的缺失,在分子信息的分类研究中,完全有可能影响分类学的研究结果。Kumata等[27]注意到来自不同菌种保藏中心的同一个Trichoderma菌株,在PCR分子指纹分析中,得出了相偏离的结果。Kelly 等在对保藏了12年的F. oxysporum f.sp. ciceris菌株的一个分离物与其它分离物相比,没有显现出应有的典型分子特征[10]。Horgen结合RFLP与染色体分析,研究了Agaricus bisporus 菌株染色体丢失、退化情况[28]。Shinohara 等发现Saccharomyces cerevisiae 在450天内经过150次的转接,菌株的染色体核型发生了微小的变化[17]F. oxysporumf.sp.niveeum 菌株在连续转接培养中发现DNA的甲基化现象[7]。斜面转接、油管等保藏方法的机理是降低菌株的代谢速率,而冻干、超低温保藏的机理是停止细胞代谢,目前对细胞代谢停止、恢复代谢后真菌基因信息、染色体信息是否完整的研究报道较少。


讨论

      避免真菌菌株在保藏过程中形态特征、生理生化性状、基因信息的发生变化对于菌株的工业化生产、分类、教学研究具有重要意义。虽然真菌菌株在长期保藏中不可避免的出现致病力下降、酶活力下降、酶活性丢失,但从Ryan 等人的研究中可以发现,采用不同的保藏程序方法可以不同程度的降低菌株长期保藏过程中退化。此外,菌株在致病活性、酶活力性状的长期保藏对保藏工艺选择性体现在“株”的水平上,同一个种菌种的不同菌株也需要进行保藏工艺的研究才能保证其形态特征、生理生化特征的稳定遗传。对于一些真菌菌株诱导酶活性的丢失,一般情况下只要真菌菌株基因信息完整,在加入相应诱导物,真菌菌株会可能重新恢复一定的产酶能力,但酶活力的产量是否得到恢复视具体情况而定。对于一些生产性的真菌菌株或工程菌株来说,多是经过诱变、基因重组、基因突变或转基因等手段得到,其基因组的稳定性相对于野生菌株来说,稳定性可能下降,此类菌株在长期保藏的过程中需要特殊的保藏工艺处理,才能够保证基因信息的稳定遗传。

 

      致谢:此工作是在CABI Bioscience UK Center Egham工作学习期间完成,Dr. Smith 和Dr. Ryan给予了极大的指导与帮助,在此表示衷心的感谢。


The long preservation of fungi and changes in characters

       Gu Jin-Gang*  Li Shi-Gui  Jiang Rui-Bo

Agricultural culture Collection of China  Zhongguancun South Street 12, Beijing

*Correspondence author: jggu@caas.ac.cn

Abstract: It is important that stability of fungi characters including morphology second metabolite production enzyme production and genomic intergrity of fungi for taxonomy teaching utilization and production of biomolecules. In this view, the changes of fungi such as sectors losing pathogenical activity reducing enzyme production and losing second meaecond metabolite production were summaried.

Key word: long preservation  morphological characters  physiological and chemical characters

 

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[1] 通讯作者:E-mail:jggu@caas.ac.cn